Von Einzelkolonienkann eine Bouillon (Pepton-Hefeextrakt- (PYG) oder
Chopped-Meat-Carbohydrate-(CMC)-Bouillon) beimpft werden, aus der später
Prüfung auf Kohlenhydratspaltung und eventuell die Gaschromatographie sowie
die Resistenztestung durchgeführt werden können.
Eine gleichzeitige, aerobe und anaerobe Aussaat auf Blutagar sichert die
Verdachtsdiagnose "strikter Anaerobier" und dient zudem als Reinheitskontrolle
für die Bouillon. Die "konventionelle Bunte Reihe" stellt die Standardmethode
zur Prüfung des Kohlenhydratabbaus und anderer biochemischer Reaktionen (Nitratreduktion,
Gelatinase, Argininhydrolyse und Tryptophanabbau) dar. Das Basismedium zum
Nachweis von Kohlenhydratspaltung bildet die Pepton-Hefeextrakt-Bouillon,
die einzelnen Kohlenhydrate werden hinzugegeben.
Solche Medien sind vorreduziert und mit einem Gummiseptum luftdicht verschlossen
im Handel (Fa. Remel).
Zur Beimpfung werden 100-200µl Inokulum, z.B. aus der CMC mit einer Kanüle in
das Medium eingebracht. Eine Bebrütung unter anaeroben Bedingungen
ist nicht erforderlich. Die Inkubation erfolgt bei schnellwachsenden Anaerobiern
(Gattung Bacteroides) für zwei oder drei Tage, bei langsam wachsenden
Anaerobiern bis zu 10 Tagen bei 35°C.
Die Bebrütungszeit der beimpften Pepton-Hefeextrakt-Glukose (PYG) oder der
Chopped-Meat-Bouillon (CMC) sollte bei der Identifizierung von Porphyromonas-Arten
1 Woche nicht unterschreiten.
Sind die Medien selbst hergestellt und luftdurchlässig verschlossen, empfiehlt
sich eine Vorreduzierung (z.B in Anaerostaten, mind. 24 h). Nach Beimpfung ist
dann eine Bebrütung in anaerober Atmosphäre erforderlich.
Eine eingetretene pH-Änderung des Mediums muss exakt, am besten mittels einer
pH-Elektrode, bestimmt werden (ein pH-Indikator ist dem Medium micht zugesetzt).
Beurteilung:
Kohlenhydratabbau
Kohlenhydratabbau wird durch Säureproduktion nachgewiesen.
- positiv = pH < 5,5
- schwach positiv = pH 5,6 - 6,0
- negativ = pH > 6,1
Aeskulin-Hydrolyse
- positiv = Schwarzfärbung nach Zugabe von Eisensalz
- negativ = keine Schwarzfärbung nach Zugabe von Eisensalz
Argininhydrolyse
- positiv = pH > 7,2
- negativ = pH < 7,2
Nitratreduktion
NO3 zu NO2; Nachweis des gebildeten Nitrits durch Zugabe von Griess-Ilosvay-Reagenz
- positiv = Rotfärbung
- negativ = kein Farbumschlag
vollständige Reduktion zu N
2; Prüfung durch Zugabe von Zinkstaub
- positiv = kein Farbumschlag
- negativ = Rotfärbung
Indolnachweis
Zugabe von Kovacz-Reagenz
- positiv = nach leichtem Schütteln ist das nach oben steigende Reagenz rot
gefärbt
- negativ = keine Färbung des Reagenzes
Gelatinasenachweis
Das bebrütete Gelatinemedium wird unter 20°C (evtl. bis Kühlschranktemperatur)
abgekühlt. unbeimpftes Kontrollmedium mitführen
- positiv = das Medium bleibt flüssig
- negativ = Erstarrung des Mediums
Galle-Resistenz
Die Trübung der PY-Galle wird mit der der PY-Glukose verglichen
- Galle sensibel = Trübung PY-Galle < Trübung PY-Glukose
- Galle resistent = Trübung PY-Galle = Trübung PY-Glukose